W celu obserwacji podziałów jądra komórkowego roślin należy wykonać preparaty rozgniatane. Uzyskuje się w ten sposób preparat z całymi nieuszkodzonymi komórkami. Zastosowanie takiego rozwiązanie daje nam pewność, że wszystkie chromosomy pozostały wewnątrz komórki i w łatwy sposób można je policzyć.

Dobrze wykonany preparat do obserwacji mitozy powinien zawierać dużą ilość płytek metafazowych, w których chromosomy są bardzo dobrze widoczne. Procedura wykonania preparatów obejmuje następujące etapy:

• zebranie odpowiedniego materiału,
• skrócenie chromosomów i zsynchronizowanie podziałów,
• utrwalenie materiałów,
• maceracja tkanki,
• wykonanie preparatu,
• barwienie chromosomów

Zebranie i przygotowanie materiału do badań

Najlepszym źródłem komórek mitotycznych są merystemy wierzchołkowe korzeni. Stożki wzrostu korzeni mogą pochodzić zarówno z roślin rosnących w glebie, doniczkach czy kulturach hydroponicznych, ale najlepiej jest pozyskiwać je z siewek. Można je również otrzymywać umieszczając nasiona na wilgotnej bibule w szalkach Petriego pozostawiając na kilka dni zazwyczaj w temperaturze pokojowej. Do badań komórek mitotycznych można równie wykorzystać merystemy wierzchołkowe pędów lub młode pąki kwiatowe.

Traktowanie materiału przed utrwaleniem

Merystemy wierzchołkowe korzeni charakteryzują się asynchronicznym podziałem komórek. W celu synchronizacji podziałów i uzyskania w tkance jak największej ilości komórek w stadium metafazy z jednoczesnym skróceniem chromosomów stosuje się:

• traktowanie tkanki wodą i lodem – obcięte stożki wzrostu zanurza się w naczyniu z wodą destylowaną o temperaturze 0°C, a następnie stożki umieszcza się w pojemniku z lodem na około 24 godziny
• traktowanie 8-hydroksychinoliną – korzonki przechowuje się przez 3-4 godziny w temperaturze 18°C lub przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, a następnie 2 godziny w lodówce w 0,002 M wodnym roztworze 8-hydroksychinoliny
• traktowanie kolchicyną – merystemy wierzchołkowe przechowywać przez 2-3 godziny w temperaturze pokojowej w ciemności w wodnym roztworze kolchicyny o stężeniu od 0,2 do 1%
• traktowanie kumaryną – wierzchołki korzeni inkubować przez 3-6 godzin w temperaturze 10-25°C w 2% roztworze kumaryny. Metoda jest mało skuteczna w przypadku gatunków o dużej liczbie chromosomów
• traktowanie P-dwuchorobenzenem – stożki wzrostu inkubuje się przez 3-5 godzin w temperaturze 12-16°C w nasyconym roztworze P-dwuchlorobenzenu. Metoda ta jest szczególnie skuteczna w przypadku gatunków o dużej liczbie chromosomów
• inne związki – innymi związkami wykorzystywanymi podczas inkubacji materiału przed utrwaleniem są: α-bromonaftalen, winkrystyna, winblastyna, oleandryna, dezacetylooleandryna

Utrwalanie materiału do badań

Do utrwalania roślinnego materiału biologicznego najczęściej stosuje się płyn Carnoy’a, który jest mieszaniną alkoholu etylowego absolutnego i kwasu octowego lodowatego w stosunku 3:1. Płyn Carnoy’a jest utrwalaczem, który szybko penetruje tkankę, dokonuje jej wstępnej maceracji oraz korzystnie wpływa na barwienie i morfologię chromosomów.

Materiał do badań należy umieścić w zimnym i świeżo przygotowanym utrwalaczu i pozostawić w temperaturze 4°C przez okres od 0,5 do 48 godzin.

Innymi utrwalaczami wykorzystywanymi w badaniach cytogenetycznych roślin są: płyn Carnoy’a zmodyfikowany, utrwalacz Nawaszina, FAA, kwas octowy lub kwas chromowy.

Maceracja tkanki

Podstawowym warunkiem uzyskania dobrych jakościowo gniecionych preparatów mikroskopowych jest wcześniejsze zmacerowanie tkanki. W celu zmacerowania tkanki najczęściej stosuje się:

• kwaśną hydrolizę – kwaśną hydrolizę przeprowadzić można na dwa sposoby. Pierwszym jest inkubacja w HCl w temperaturze 58-60°C przez 5-12 minut lub w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Drugim sposobem jest inkubacja w 45% kwasie octowym w temperaturze pokojowej przez 2-3 godziny lub w temperaturze 60°C przez 5-20 minut
• macerację enzymatyczną – podczas maceracji enzymatycznej stosuje się następujące enzymy maceracyjne: pektynazę 10% (w temp. 37°C przez ok. 3 godziny), celulazę, mieszaninę celulazy i pektynazy lub macerozym, w którego skład wchodzi pektynaza, celulaza i hemicelulaza.

Metody barwienia chromosomów:

• metoda acetoorceinowa,
• metoda acetokarminowa,
• barwienie nigrozyną,
• metoda Feulgena
• metoda laktopropionoorceinowa
• metoda karmin – kwas propionowy

Planujesz badania chromosomów roślin? Sprawdź ofertę naszego sklepu laboratoryjnego i odwiedź sekcję poświęconą histologi.